Методы исследования онкобелка HER-2/neu

Основные представления о рецепторе HER-2/neu

Активация и гиперэкспрессия клеточных онкогенов, как известно, играет важную роль в развитии злокачественных опухолей различной этиологии [1]. Одним из важнейших продуктов экспрессии онкогенов является рецептор известный как Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2) [2], который также известен как HER-2/neu или c-erbB-2, т.к. структурно и функционально схож с  с-erbB онкогеном ретровирусной природы [3]. HER-2 является частью семейства онкогенов с-erbB, включающего еще три рецептора HER-1, HER-3, HER-4 (75) (рис. 1).

Рисунок 1. Семейство рецепторов эпидермального фактора роста.

Белок HER-2/neu - это трансмембранная рецепторная тирозинкиназа, экспрессирующаяся преимущественно на эпителиальных клетках и кодируемая геном, локализованным в 17q хромосоме. Молекулярная масса рецептора HER-2/neu составляет 185 килодальтон (kDa), поэтому его также иногда называют белком р185.  Молекула рецептора состоит из внутреннего тирозинкиназного домена, небольшой трансмембранной части, а также из внеклеточного домена (ВКД), который подобен таковым и у других членов HER- семейства (2,4). Внеклеточная часть рецептора является высоко гликоли- зированным белком с молекулярной массой от 97 до 115 kDa и определяется как в среде культивирования некоторых линий клеток РМЖ, так и в плазме или сыворотке  [5] крови здоровых женщин и больных РМЖ. Механизм активации HER-2/neu в настоящее время не совсем понятен, но исследования показали, что рецепторы семейства HER образуют гомо- и гетеродимеры, в результате чего активируются внутренние тирозинкиназы и весь последующий каскад событий регулируемого ими сигнального пути [6] Лиганд к рецептору HER-2/neu до настоящего времени не обнаружен. Родственные рецепторы активируются многочисленными лигандами, среди которых собственно эпидермальный фактор роста (ЭФР), а-трансформирующий фактор роста, амфирегулин и др., активирующие рецептор 1 типа - HER-1, а также, открытое относительно недавно, семейство пептидных лигандов, названных неурегулины, имеющие моллекулярную массу около 45kDa и взаимодействующие преимущественно с рецепторами HER-3 и HER-4.

Методы определения HER-2/neu

Наиболее широко используемой методом определения гиперэкспрессии белка HER-2/neu является иммуногистохимический [7], для определения числа копий или амплификации гена HER-2/neu используется метод флюоресцентной гибридизации in situ (Fluorescent In Situ Hybridization - FISH).

В настоящее время, с появлением коммерческих наборов для проведения иммуногистохимического анализа, стало возможным стандартизировать методики определения экспрессии HER-2/neu.Американское Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration)   одобрило два вида антител для иммуногистохимического определения выявления больных, являющимися кандидатами для терапии Герцептином. Они включают Herceptest (DAKOCytomation, Copenhagen, Denmark) и Pathway (Ventana, Medical Systems, Tucson, AZ). Стандартизированная система подсчета и интерпретации результатов иммуногистохимического анализа была разработана с помощью стандартных клеточных линий. В данной системе клетки, содержащие менее 20 000 рецепторов, не покажут никакого окрашивания (0); клетки, содержащие приблизительно 100 000 рецепторов, показали бы частичное окрашивание мембраны менее, чем у 10 % клеток (1+); в клетках, содержащих около 500000 рецепторов, полное окрашивание будет наблюдаться в более чем 10% клеток (2+); полное и сильное окрашивание мембраны больше чем у 10% клеток, показали бы клетки, содержащие приблизительно 2 300 000 рецепторов (3 +) [8].

Вторая методика, используемая для определения HER-2/neu статуса - это FISH анализ (флюоресцентная гибридизация in situ). Преимущества данной методики заключается в возможности определить амплификацию или количество копий гена, кодирующего рецептор HER-2/neu. Техника FISH анализа очень надежна, обеспечивая чуствительность 95,5% и 100% специфичность для обнаружения амплификации гена HER-2/neu. В настоящее время применяются два коммерческих набора для FISH анализа, разрешенные к применению FDA: PathVysion (Vysis, Downers Grove, IL), рекомендованный для пациенток с региональными метастазами, подлежащих адъювантной терапии антрациклин-содержащими схемами, а также для выявление группы больных, у которых возможна терапия Герцептином, и Inform Test (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), используемый в качестве прогностического фактора у пациенток с раком молочной железы  (РМЖ) без региональных метастазов [9].

Иммуногистохимический метод достаточно прост в выполнении и может применяться в условиях большинства патологоанатомических лабораторий, FISH-метод более дорогостоящий и трудоемкий, требующий специального оборудования. Поэтому, как правило, второй метод используется для подтверждения или уточнения результатов полученных с использованием иммуногистохимического анализа (табл.1).

Таблица 1. Взаимосвязь иммуногистохимического и FISH методов

по определению статуса HER-2/neu [11].

Позже была предложена новая методика CISH (chromogenic in situ hybridization), как альтернатива FISH методу. Данная методика основана, в отличие от флюоресцирующей техники, на пероксидазной реакции, которая может визуализироваться с помощью обычного микроскопа и устраняет потребность во флуоресцентном оборудовании. Хотя технические преимущества CISH по сравнению с FISH методом были продемонстрированы, однако, в настоящее время FDA не рекомендует использовать данную методику в клинической практике. Необходимо продолжать исследования, чтобы с полной уверенностью утверждать об адекватности двух методов (10,35).Сравнивающей иммуногистохимический и FISH методы, показал значительную степень соответствия результатов. Множество сообщений говорит о более чем 90% совпадений ИГХ и FISH результатов при гиперэкспрессии HER-2/neu (3+), в некоторых случаях достигая 100%  [9].

Третий метод, используемый для определения статуса HER-2/neu – это иммуноферментный метод (ELISA). Он может использоваться для количественного определения всего белка р185 в опухоли или его циркулирующего растворимого фрагмента в плазме или сыворотке крови. Zabrecky и др. [10], используя моноклональные антитела, направленные на ВКД HER-2 , продемонстрировали, что фрагмент рецептора HER-2/neu мигрировал во внеклеточную среду. В последние несколько лет описано множество иммуноферментных методик, используемых для определения ВКД в плазме и сыворотке больных РМЖ и контрольных группах здоровых женщин. Однако отсутствие стандартизации этих методов затрудняет сравнение результатов, полученных разными авторами.

В целом, иммуногистохимический и FISH методы - это единственные тесты, рекомендованные FDA для выявления групп больных метастатическим РМЖ, подлежащих терапии Герцептином [9]. В настоящее время иммуногистохимический и FISH методы используются в комплексе, что позволяет более точно отбирать группы пациенток для таргетной терапии.

Библиогафия

1. Aaronson SA. Growth factors and cancer. Science 1991;254:1146- 1153.
2. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230:1132-1139.
3. Bargmann CI, Hung MC, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor related protein. Nature 1986;319:226- 230.
4. Brandt-Rauf PW, Pincus MR, Carney WP. The c-erbB-2 protein in oncogenesis: molecular structure to molecular epidemiology. Crit Rev Oncog. 1994;5(2-3):313-29.
5. Pupa SM, Menard S, Morelli D, Pozzi B, De Palo G, Colnaghi MI. The extracellular domainof the c-erbB-2 oncoprotein is released from tumor cells by proteolytic cleavage. Oncogene 1993;8:2917-2923.
6. Kurebayshi J. Biological and clinical significance of HER2 overexpression in breast cancer. Breast Cancer 2001;8:45-51.
7. Ross JS, Fletcher JA. BER-2/neu (c-erbB2) gene and protein in breastcancer. Am J Clin Pathol 1999;112:S53-S67.
8. Hayes DF, Thor AD. c-erbB-2 in breast cancer: development of a clinically useful marker. Semin Oncol 2002;29:231-245.
9. Schaller G, Evers K, Papadopoulos S, Ebert A, Buhler H. Current use of HER2 tests. Ann Oncol 2001 ;12:S97-S 100.
10. Zabrecky JR, Lam T, McKenzie SJ, Carney W. The extracellular domain of pi 85 is released from the surface of human breast carcinoma cells, SK-BR-3. J Biol Chem 1991;266:1716-1720.
11. Mass RD, Proc Am Soc Clin Oncol, abstract 19, 2000

Вопросы, ответы, комментарии